本文目录一览：

• 1、里氏木霉（T.reesei）
• 2、哈茨木霉（T.harzianum）
• 3、目前最全的丛枝菌根真菌基因组（8个菌种）
• 4、中国批准的7种益生菌有哪些？
• 5、哪些菌种可以用于食品？

里氏木霉（T.reesei）

T.reesei，一种无性繁殖的丝状真菌，是重要的降解纤维素材料的丝状真菌的一种，可分泌一整套降解纤维素的酶系。其中以外切葡聚糖、纤维二糖水解酶的产量最高，占胞外分泌蛋白总量的60%以上。T.reesei长期被用于生产纤维素酶、半纤维素酶和蛋白酶等多种酶类（王肖燕，2012）。T.reesei具有典型的真核蛋白修饰特性和理想的蛋白分泌能力，已被作为基因工程宿主菌用于生产外源蛋白，并且为生产药用人源蛋白进行遗传改造，例如N-糖基化路径的人源化改造。龙昊等的T.reesei全基因组测序工作已经完成，对深入了解该工业菌株具有重大意义，同时为鉴定与该菌生长代谢相关的关键基因提供了良好平台。

Chritian等（2013）分析了一株T.reesei Rut-C30突变菌株，其具有非常高水平的木聚糖酶表达量（即使在无诱导物添加的情况下）。研究揭示这株菌由于编码木聚糖酶的Xyr1基因单位点突变，导致内生木聚糖酶一反常态地表达量升高，并且伴随着纤维素酶表达量的提升。这个突变位点通常位于双核锌簇转录因子区域。但只在槐糖诱导下纤维素酶含量才有些微小的提升。在所有分析条件下，cbh1和cbh2的转录水平形成受到xyr1转录水平的严格限制。与野生型QM6a不同的是，在突变体菌株中xyr1与cbh1/cbh2在转录水平和槐糖可诱导性方面并无严格相关性，但在野生型菌株中确实严格相关。

Kautto等（2013）结合生物化学、转录组学和激光共聚焦方法，分析了T.reesei中纤维二糖分解酶Ⅰ（CBHI）突变造成的细胞水平效应。将突变的CBHI进行荧光标记，构建融合蛋白的亚细胞定位系统及与蛋白酶组关联。突变的CBHI造成了Rut-C30的某些生理改变，例如菌丝，并影响了酶的分泌。一批与 UPR-和ERAD-相关基因 sec61，der1，uba1，bip1，pdi1，prp1，cx1和lhs1得到正调控。进一步借助MG132（N-benzoylcarbonyl（Cbz）-Leu-Leu-leucinal）抑制蛋白酶的功能。MG132 对蛋白酶编码基因具有特殊的作用，这项研究首次报道了丝核菌中蛋白酶对蛋白品质的调控作用。激光共聚焦分析认为，突变CBHI在ER中累积，并与蛋白酶共处。这项研究揭示了在一定的分泌压力下，T.reesei Rut-C30高产蛋白是有一定限度的。

利用分子标签技术获得突变体已成为进行基因克隆和遗传分析最有效的方法之一。建立T.reesei基因标签的插入突变体库是该领域功能基因组学发展的趋势（钟耀华等，2007）。Zhang等（2011）建立了高效的T-DNA插入突变筛选系统。他们认为农杆菌介导的T-DNA转化作为建立插入突变和研究基因功能行之有效的手段，需要同样高效的转化及筛选步骤。研究者利用绿色荧光蛋白（GFP）作为重要标记，建立了T.reesei高效T-DNA插入突变和筛选系统。一株尿苷营养缺陷型菌株M23被转进农杆菌EH105携带的整合了pyrG基因（用于在不添加尿苷的基本培养基中初筛）和egfp基因（用于对遗传稳定菌株进行荧光筛选）的双向质粒pCOEP，转化效能可达10～20转化子每105个目标分生孢子。通过荧光显微镜可在分生孢子、生长菌丝和菌丝中检测到GFP荧光蛋白强烈的信号。研究建立了T.reesei中通过96孔板和多标号计数记录荧光强度的快速高效筛选 T-DNA标签突变体的方法。进一步，通过Southern杂交分析确定了基因组中T-DNA的插入状态。该研究利用GFP作为重要标记，建立了T.reesei中快速鉴定染色体水平上T-DNA插入突变和功能基因分析的方法体系。

木霉研究中，菌株高效筛选标记的数目有限，难以实现对菌株的多基因连续敲除。因此，建立丝状真菌选择标记删除系统有利于对丝状真菌进行多次遗传改造。尿嘧啶营养缺陷型标记具有转化效率高、容易得到转化子等优点，研究中通常将尿嘧啶营养缺陷型的互补基因pyrG转入相应的营养缺陷型菌株，使pyrG基因与受体菌的缺陷基因互补，使受体菌表现野生型生长而作为选择标记。构建基因敲除载体时，在标记基因联测时分别添加一段短的正向重复序列，这样转化，用来切除转化子中的pyrG基因，再在添加5-氟乳清酸（5-FOA）的培养基上筛选即可得到不带有标记基因的目的基因敲除菌株。该策略在多基因连续敲除中，可实现选择标记的重复使用而不引入其他标记基因（王肖燕等，2012）。

基因工程研究中，影响外源蛋白产量的因素有启动子强度、启动子拷贝数、信号肽和蛋白质稳定性等。内源基因的高效表达可能会影响外源蛋白的产量。王肖燕等（2012）认为，T.reesei表达外源蛋白时，cbh1，cbh2，eg1，eg2等主要内源基因在机体内相对高效的表达势必会影响外源基因的表达，他们以此为背景构建了T.reesei主要内源纤维素酶基因缺失菌株，目的在于提高外源蛋白的表达量。他们利用重组PCR技术分别构建了以尿嘧啶营养缺陷（pyrG）为选择标记的cbh1和cbh2敲除盒，并添加了一个短的正向重复序列，以保证筛选标记基因的重复利用。两基因敲除盒分别转化T.reesei Δtku70菌株，基本培养基上筛选得到基因单敲除菌株Δcbh1：：pyrG+和Δcbh2：：pyrG+。继而用5-氟乳清酸对Δcbh1：：pyrG+反筛，得到不带标记基因的cbh1基因敲除菌株Δcbh1。并在敲除cbh1的基础上进一步敲除cbh2，构建两基因双敲除菌株Δcbh1Δcbh2：：pyrG+，经过5-氟乳清酸反筛去除标记基因得到双敲除菌株 Δcbh1Δcbh2。接着对 T.reesei 转化子进行了 PCR，Southern验证和PAGE 分析，实验结果表明基因缺失菌株构建成功，其中 Δcbh1和Δcbh1Δcbh2菌株已不含有原先转入的筛选标记基因。菌株培养物上清液PAGE电泳分析：cbh1缺失菌株Δcbh1外切葡聚糖酶I的量与出发菌株相比明显下降，而外切葡聚糖酶II的分泌量有所提高；cbh2缺失菌株Δcbh2：：pyrG+外切葡聚糖酶Ⅰ的量与出发菌株相比没有太大的变化，外切葡聚糖酶Ⅱ的分泌量有所下降；cbhl/lcbh2双缺失菌株Δcbh1Δcbh2外葡聚糖酶I和外切葡聚糖酶II的量与出发菌株相比均明显下降。该研究对T.reesei Δtku70菌株进行目的性的分子生物学遗传改造，成功构建了cbh1和cbh2 基因单敲除及双敲除菌株。研究中在标记基因两侧各添加一段短的重复序列使标记基因重复利用的策略为多基因的连续敲除提供了一条行之有效的途径。

龙昊（2006）建立了pyrG基因选择标记建立的T.reesei转化体系。他们利用紫外线诱变技术获得了一株T.reesei pyrG基因缺陷菌株M23。该菌株在不含尿嘧啶核苷酸的培养基上无法生长，而转化含有pyrG基因的质粒pAB4-1后可正常生长。转化率为每微克质粒200～300个转化子，该研究构建的pyrG基因缺陷型菌株的获得为构建T.reesei的新遗传转化系统奠定了基础。

钟耀华等（2007）利用农杆菌AGL1介导成功转化了T.reesei QM9414。研究将T-DNA随机插入T.reesei染色体中，获得一批T.reesei T-DNA插入突变体，并得到具有潮霉素抗性的转化子，转化效率和稳定性高。序列分析证明T-DNA为随机插入T.reesei染色体中的。研究共获得经分子验证的突变菌株200余株，建立了插入突变体库。他们进一步对突变体子库进行表型筛选，发现了7株形态异常的突变子，有其中两个突变子的T-DNA插入位点恰好位于同一个基因的不同位点，通过序列对比和系统分析，该基因编码类胡萝卜素双加氧裂解酶（CCD），被命名为TrCCD1基因。两个突变子的T-DNA插入位点分别位于TrCCD1的开放阅读框和启动子区（Promoter），分别被命名为ccdO和ccdP。两突变体比出发菌株在MM平板上生长减速近一半，菌落也相对疏松；在含0.2%TritonX-100的MM平板上生长始，突变子菌落形成长的气生菌丝，导致菌落蓬松；突变子的菌丝顶端与菌丝中间区域相比明显有变化，即菌丝顶端颜色变暗；突变子在PDA平板培养4d后，仅有中间部位产生绿色孢子，周边围绕白色菌丝，而出发菌株产孢面积明显较大。他们利用丙酮对分泌到培养基的类胡萝卜素进行吸光度检测和β-胡萝卜素高效液相色谱（HPLC）测定。突变菌株分泌到PDA培养基中的β-胡萝卜素比出发菌株降低近一半。说明TrCCD1基因的突变与类胡萝卜素的含量直接相关，而且在类胡萝卜素的代谢中具有重要作用。他们推测，突变影响了某种具有重要信号作用的类胡萝卜素分子的生成，从而导致了T.reesei菌丝生长和孢子发育的异常，也同时说明TrCCD1基因在生长发育过程中扮演了重要的调控作用。另外5株突变子（PM2，PM48，HP7，HP13和HPL1）也形态各异，与出发菌株有明显区别，菌丝延伸较慢，有的菌落呈明显辐射状，有的菌落布满白色菌丝，无产孢迹象。其中PM2的菌丝顶端弯曲缠绕，形成了卷曲成团的头部。通过TAIL-PCR扩增分析，PM48的插入位点在一个编码细胞周期相关蛋白的基因编码区，HPL1的插入位点编码的蛋白可能是一个多聚腺苷酸结合蛋白，该基因突变引起了纤维素降解能力的变化。为了获得纤维素降解突变菌株，钟耀华等（2007）利用CF11平板透明圈筛选法，筛选到4株纤维素降解突变子：PM3，PM23，HPL1和36H-6。其中，PM3和PM23的透明圈增大，HPL1和36H-6的透明圈减小。纤维素酶活力测定发现，各菌株的FPA活力在18～24h之间达到高峰值，其中PM3和PM23的FPA最高活力比出发菌株高30%以上，PM3也是最先达到酶活最大值的菌株，而PM23的FPA活力持续时间最长。突变子HPL1和36H-6的FPA活力始终低于出发菌株，HPL1的FPA活力一直处于较低水平，最高酶活力仅为出发菌株的三分之一；36H-6的酶活力随时间延长下降很快，48h就几乎丧失活力。各突变体菌株的CMCase都是在24h达到酶活高峰，PM3和PM23的最大酶活力比出发菌株高，而HPL1和36H-6比出发菌株低。值得注意的是，HPL1的FPA和CMCase活力始终处于较低水平。他们同样利用TAIL-PCR分析了HPL1菌株T-DNA右侧翼序列，发现该突变基因编码的蛋白可能是多聚腺苷酸结合蛋白，突变位点位于基因上游26bp处，基因功能与RNA加工和修饰有关。

傅科鹤（2013）针对在玉米生产过程中拮抗T.reesei受到重金属等理化逆境因子，而影响其生物防治效果的现象，期望通过突变体菌株创造耐受或吸附重金属的生防菌剂，将对研究木霉菌剂与含重金属的化学农药混用具有实际意义。研究采用了ATMT突变体系统构建方法，构建了1800余株突变体的突变体库，其中一株高吸附突变体A01的铜吸附特性较为突出。当培养基内铜离子初始浓度为0.7mM，初始pH值为5.0时，AT01的铜吸附率达到了96.1%，几乎二倍于野生菌的铜吸附特性；同时，由于铜吸附作用，AT01的菌体颜色呈现明显的铜绿色，表明细胞吸附了大量的铜离子。进一步的透射电镜观察表明，铜进入细胞内后，主要累积在液泡中。通过Southern印记分析，该突变体为T-DNA单拷贝插入，并且其右边界全部缺失而左边界完整（通过反向PCR扩增插入位点侧翼序列）。进一步对插入点基因情况进行分析，发现T-DNA插入在一个基因家族的两个功能基因之间，未对功能基因进行直接破坏。通过生物信息学分析3个与铜吸附相关基因，分别为TM，Ctr2，Ctr3，其中TM编码转录因子，调控胞外低浓度铜胁迫下跨膜通道蛋白（与铜吸附相关）表达，从而促进细胞对铜吸附作用，维持胞内同正常浓度。当ATMT介导基因被敲除后，在含0.2m MBCS（铜螯合剂）的TPDA培养基中培养时生长受到明显限制，菌落直径仅为野生菌的18%，说明该基因对细胞铜吸收功能有重要作用，而且基因互补发现功能得到恢复。随后的荧光定位实验显示，培养基添加BCS后，TM编码蛋白具有表达信号，初期在核内表达，后期转移到胞壁与某些通道蛋白结合。另外两基因Ctr2，Ctr3为铜吸附相关功能基因，被敲除后，Ctr2铜吸附能力比野生型降低20%，Ctr3无明显变化。Ctr3y荧光定位互补结果表明，编码蛋白主要在细胞壁。

物理诱变主要是紫外诱变方法被应用在T.reesei突变体系的构建中。乐易林等（2004）对T.reesei Rut C-30通过紫外照射进行诱变，选育出了一株高产木聚糖酶活力的菌株，其酶活比出发菌株提高。并通过正交试验证明了培养时间对产酶的影响最大，其次是磷酸钾和七水硫酸镁，培养温度对酶活影响最小。覃玲灵等（2011）利用T.reesei产纤维素酶的特性，通过紫外辐射诱变筛选出高产纤维素酶的突变菌株，进一步提高纤维素酶的产量，降低生产成本。研究者对T.reesei Rut C-30的孢子悬液进行紫外线诱变（处理40min，致死率83.5%，正突变率8.679%），刚果红筛选培养基初筛、液体发酵产酶复筛后，获得一株突变体A13，其滤纸酶活为4.328U/mL，比出发菌株提高了55.3%。六世代连续培养后，酶活力可以稳定在4.160U/mL，且遗传稳定性好。正交试验得到突变体A13产酶的最佳条件：1.00%微晶纤维素（碳源）、0.15%蛋白胨+0.05%硫酸铵（复合氮源），产酶温度28℃，优化后，A13的纤维素滤纸酶活比优化前提高了18.15%。另外，在微晶纤维素的产酶培养基中添加适量麦芽浸粉可促进产纤维素酶（添加1%麦芽浸粉）。随后对4株突变菌株及出发菌株进行RAPD分析，对RAPD-PCR反应体系进行优化筛选6个随机引物，对扩增条带进行聚类分析，结果显示突变菌株和出发菌株间具有较近的亲缘关系，但存在一定的遗传变异。

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哈茨木霉（T.harzianum）

根癌农杆菌介导的遗传转化法（Agrobacterium Tumefaciens-Mediated Transformation，ATMT）已被广泛地应用于丝状真菌的插入突变。以具有植物病害生物防治功能的T.harzianum LTR-2的分生孢子为实验材料，研究建立了T.harzianum的高效ATMT插入技术（李国田等，2006）。该技术无须制备原生质体，具有操作简单、转化效率高和突变体遗传稳定等特点，转化效率约为200～300个/107分生孢子。通过继代培养和PCR检测，证明T-DNA中的潮霉素抗性基因插入木霉基因组中并可以随着有丝分裂稳定遗传。South-ern 杂交分析表明，T-DNA在木霉染色体上的插入位点是随机的，并且大约有90%突变体的T-DNA 插入是单拷贝。利用上述 ATMT 突变技术，建立了T.harzianum菌株LTR-2的插入突变体库。共得到具有潮霉素抗性的突变体400余个，主要考察了以下性状的变异情况：①形态变化：大部分菌落形态变化不大，具有明显变化的约占总数的2%，分生孢子颜色也基本没有变化，仍然为绿色，T1-25 突变体产生的分生孢子为黄褐色，但后期仍然显出绿色，产孢量减少；②拮抗能力变化：突变体与立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）进行平板对峙实验，抑菌能力降低的约占28%，增强的约占56%，无变化的约占16%；③重寄生能力变化：36.2%的突变体重寄生能力减弱，其中T4-59和T4-31几乎丧失重寄生能力，51%的突变体增强。说明ATMT插入突变技术能够造成原始菌株的随机突变，是研究功能相关基因信息的有力工具，而该突变体库的构建，为研究木霉的植病生防功能基因提供了丰富的种质资源。选择重寄生能力较强、减弱和基本丧失的突变体 T2-58，T2-60，T1-25，T4-31，T4-59，以野生型LTR-2 为对照，以病原菌谷禾丝核菌（Rhizoctonia cerealis）为靶标，盆栽条件下测定了这些突变体对小麦纹枯病的生物防治活性，发现重寄生能力显著减弱的突变体 T4-59和T4-31 对小麦纹枯病的防治效果明显降低，约降低7%～13%，而重寄生能力明显增强的菌株T2-58和T2-60则对病害的防治效果明显增强，约增强10%～12%，说明木霉的重寄生能力与其生防活性密切相关。进一步的研究应利用这些突变体，探索与重寄生能力相关的基因信息。

5，6-二氢-6-戊基-2H-吡喃-2-酮（5，6-dihydro-6-penty-l2 H-pyran-2-one）是木霉菌产生的一种抗生素，具有椰子香味，生物活性高，对小麦纹枯病和棉花立枯病等多种植物病害都有显著的防治效果，因此具有很大的潜在应用价值。通过土壤杆菌介导的T-DNA转化方法，利用土壤杆菌菌株携带的Ti质粒，对绿色木霉LTR-2进行插入突变，获得木霉LTR-2突变体共400株。以串珠镰孢菌为指示菌，采用抑菌圈方法，从中筛选吡喃酮高产突变体6株，PCR和探针杂交证实，T-DNA序列已经插入木霉LTR-2基因组。经GC-MS分析发现，其中一株突变体T-54在PDA培养基上产生的吡喃酮含量较高，在分生孢子中的含量达到了2.62mg/g，比野生菌株提高9倍（扈进冬等，2010）。

利用T-DNA整合的方式，产生木霉菌突变体并进一步筛选的方式十分普遍。黄亚丽等（2010）通过对T.harzianum转化效率的因素具体研究，建立了转化效率高的体系，建立了含有8千多个转化子的突变体库。黄亚丽等（2010）还研究了整合过程中的机制，他们根据T.harzianum的基因组特点，采用12条随机的AD引物，并分别与3条右边界嵌套特异引物的组合对T.harzianum突变子的T-DNA侧翼未知序列进行扩增，选出扩增效率最高的引物AD5，对T.harzianum的52个突变子进行Tail-PCR扩增，分析扩增序列后发现，获得的42条侧翼序列中，有7条只含有质粒序列，33条为单一的侧翼序列，其余2条的序列相同。其中34条T-DNA侧翼边界序列中1/3的序列保存着完整的右边界，其余则出现了不同程度的缺失，研究说明，在农杆菌介导转化T.harzianum的过程中，会对T-DNA右边界产生一定的剪切作用。

紫外诱变和化学诱变的方法也常被用于T.harzianum 针对性性状筛选突变体系的构建。杨合同等（2004b）通过紫外线诱变处理，获得了可以在低温下（10e）生长的绿色木霉LTR-2的快速生长型突变株LR，以及对多菌灵具有抗性的突变株LRR。突变株对棉枯萎病菌、棉黄萎病菌、棉立枯病菌的平板拮抗能力一般低于野生型菌株。与野生型菌株相比，突变株在PDA平板上对棉花立枯病菌、枯萎病菌和黄萎病菌的抑菌圈都有变化，但是多数情况下抑菌圈变小而不是变大。LRR虽然对棉枯萎病菌和黄萎病菌的抑菌圈也较小，但是对两种病害的防治效果却略有提高。LR比LTR-2更能适合非根际土壤环境，而LRR在健康棉花根际的定殖能力上，比LTR-2有明显下降。LR对棉花立枯病基本没有防治效果，但对棉花黄萎病和枯萎病的防治效果则高于原始菌株；LRR对棉花上述3种病害的防治效果与原始菌株没有明显的差异。在PDA、玉米琼脂和NA平板上菌株LR生长速度最快，而LRR则与野生型菌株LTR-2没有明显差别。除了突变株LR在非根际土壤中的定殖能力有所提高以外，其他突变株的根际定殖能力没有明显改善，LRR定殖能力反而明显下降。该研究一方面表明紫外线诱变后目标性状变化的随机性，另一方面也说明定殖能力与抗药性间没有必然关系。紫外线诱变处理所获得的新性状容易消失，但也能够得到稳定的突变株。对木霉来说，紫外线诱变仍然是值得利用的菌株改良技术，在扩大突变体筛选基数的基础上，能够获得所需要的突变株。

Hassan等（2005）将 T.harzianum 暴露于伽马射线中，诱导两株耐盐突变菌——Th50M6h和Th50M11。在盐胁迫条件下，两株突变体的生长能力、孢子形成能力、拮抗病原菌能力均远超野生型。

安哲宇等（2010）通过紫外诱变和含药培养基诱导相结合的方法，获得了一株对三唑类杀菌剂有良好耐药性的T.harzianum的突变体，TUV-13。其抗药性为野生菌株的10倍，不同世代中的抗性比较稳定，且与原始菌株存在差异。该菌株可定殖于植物体内，植株生长产生正效应。杨春林等（2010）同样采用紫外线诱变与药剂培养驯化相结合的方法，构建了以T.harzianum Th-30为原始菌株的突变体。他们共得到4株可以比正常菌株耐受10倍福美双的变异菌株。其中，变异菌株UV-4不仅能抵抗高浓度福美双的胁迫作用，还具有几丁质酶活性。该菌株遗传性状稳定，具有福美双混用协同防治蔬菜真菌病害的功效。Zhang等（2013）的研究切入点侧重在突变体木霉对作物的促生效果上。研究通过紫外线诱变的方法从亲本SQR-T037菌株中得到124株突变体后代，并从中选择了拮抗植物病原菌能力较强的T-E5进行下一步的研究。他们比较了T.harzianum突变体菌株T-E5与野生型菌株SQR-T037，同时以施用有机肥料作为对照。研究中包括实验室和黄瓜温室试验，即对液体发酵液中植物激素的产出、对植物生长的促生能力和在植物根系根围的定制能力进行了分析评定。结果显示，T-E5相对SQR-T037，在植物生长素IAA的效率指标中提高了30.2%；相应的，T-E5处理显著提高了黄瓜无论在土壤栽培还是水培条件下的生物量。通过RT-PCR检测，在培养30d后，突变体T-E5在土壤样品中的定殖量几乎超过SQR-T037的10倍。两菌株在植物根茎内的定殖速率几乎是一致的；但每个取样时间中T-E5的定殖率均高于野生型的SQR-T037。

木霉属内及与其他真菌之间的原生质体融合，可为T.harzianum获得更多的性状功能。杨合同等（2005）以产孢量大，对苯菌灵有抗性，对潮霉素B敏感的T.harzianum菌株T9和产孢量少，对潮霉素B有抗性，对苯菌灵敏感的康宁木霉Tk7a为亲本，通过原生质体融合，筛选获得抗最高浓度杀菌剂的融合子。融合子产孢量高于Tk7a，水解酶活性比双亲号，并且在根际的竞争能力比T9强。张彩霞等（2004）对不同属间原生质体融合进行了成功尝试，他们构建了T.harzianum与链霉菌菌株原生质体融合技术。具体过程为将T.harzianum T-23与链霉菌菌株A分别以庆大霉素和50-53 e热灭活120min作为遗传标记。常规的聚乙二醇（PEG）作为融合系统的促融剂，通过调整PEG的最佳分子量及浓度和处理时间，最终确定0.05mol/L Ca2+的35%PEG6000为最佳融合系统，处理时间为15min。经过融合系统处理产生的融合子再经选择再生培养基培养后，筛选形状稳定的融合子。Srinicasan等（2009）希望通过原生质体融合的方法同时提高木霉中纤维素酶和几丁质酶的含量。在他们的研究报告中，为了构建一株既含有上述双酶特性的独一无二的高效菌株，尝试整合高纤维素酶产出活性的一株里氏木霉和高几丁质酶产出活性的一株T.harzianum的原生质体。他们利用细胞溶解酶分别从16株T.harzianum和里氏木霉中分离得到了原生质体。原生质体融合系统采用的常规的PEG作为助融剂。融合反应共获得20个生长效率高的融合子，紧接着通过抗性培养筛选，选出了六株具有良好的生长活性和拮抗活性的菌株。这六株筛选菌株自身也显示了多层次的形态多样性，包括菌丝发育、菌落颜色、分生孢子形成模式和孢子染色等。除了差异外，六个融合菌株仍具有与原始菌株相同的某些形态特征。他们进一步通过PCR-PFLP验证了融合子具有原始菌株双亲的特征指纹条带。从生长特性上看，三世代后，融合子后代的生长速率超过亲本的60%～70%。更重要的是，融合子菌株比双亲菌株提高了40%～50%纤维素酶活性和10%～20%几丁质酶的活性，并且具有高于双亲7%～8%的生物拮抗活性。

Herrera等（2012）比较了T.harzianum突变菌株和野生型菌株对杀菌剂敏感性的不同。他们将野生型T.harzianum（Th11，Th12和Th650）和突变体T.harzianum（Th11 A80.1，Th12 A10.1和Th650-NG7）同时暴露在不同的商用杀菌剂中进行研究。研究结果显示，所有的野生和突变体菌株均能在含有浓度为1700mg/L戊菌隆的条件下出芽。野生型菌株Th12和Th650及对应的突变体菌株Th12 A10.1和Th650-NG7均对不同浓度梯度的扑海因和代森锰有药敏反应。这些研究成果为T.harzianum特定突变体菌株在实际作用时，可否与抗菌剂联合施用，可施用的范围、水平等做了有意义的评估工作。

目前最全的丛枝菌根真菌基因组（8个菌种）

丛枝菌根真菌（arbuscular mycorrhizal fungi，AMF） 在系统发育上属于球囊霉亚门（Glomeromycotina），能与陆地上超过80%的植物物种（约20万种）的根系形成互利互惠的共生关系—— 丛枝菌根（arbuscular mycorrhiza，AM） 。这种极其古老（ 4.5亿年）且共进化的关系被认为是早期植物在陆地上定殖的关键因素而且也已经被大量证实一般对共生双方都是有利的。通过AMF庞大的菌丝网络，宿主植物能够获取根际范围之外的水分和养分，尤其是土壤中难以移动的磷元素。大量的研究已经证实，AMF能不同程度地提高宿主植物对干旱、盐碱、重金属、低有效态养分、极端温度（高温和低温）、酸性土壤（低pH）、铝毒和污染物（砷污染和多环芳烃）等的耐受力。AMF提高宿主植物对多种非生物胁迫的耐受力的潜在机制包括增强宿主的养分吸收、水分利用的优化、光合作用增强以及活性氧（reactive oxygen species，ROS）的清除活性增强等。鉴于AMF极为广泛的宿主范围和多样化的生理生态功能，因此在众多有益土壤微生物中地位突出。

到目前为止，仅有 334个AMF菌种 被有效鉴定出来，它们隶属于球囊霉亚门（Glomeromycotina）球囊菌纲（Glomeromycetes）的球囊霉目（Glomerales）、多样孢囊霉目（Diversisporales）、类球囊霉目（Paraglomerales）和原囊霉目（Archaeosporales）中的12个科的36个属（，2020年2月17日）。尽管已知的AMF物种数量有限，但它们广泛地分布于各种陆地生态系统中，有着极强的生态适应性。除了农业土壤和森林土壤外，在各种恶劣的自然陆地环境和人为导致的极端陆地环境中都发现了AMF的分布，例如，沙漠、盐碱地、沿海滩涂、极地冰原、珊瑚礁以及工业污染区和尾矿区。

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随着高通量测序成本的降低和测序技术的成熟，越来越多的动物、植物和微生物已经被全基因组测序，有些物种还被全基因组重测序。这些大大加深了我们对自然界的认识，也极大地方便了我们对物种进行更深一步的基因层面研究。近些年，关于AMF基因组的文章也陆续发表，趁着五一假期的空闲归纳整理了目前已经发表基因组的AMF物种。

1.  异形根孢囊霉（ Rhizophagus irregularis  DAOM197198 ）

在较早的文献中， Rhizophagus irregularis 也被称为 Glomus intraradices 。实际上这是两个完全不同的物种，前者的中文译名为异形根孢囊霉，而后者则为 根内根孢囊霉（ Rhizophagus intraradices ） 。关于这个区别，王幼珊和刘润进两位老师已经在2017年发表的 《球囊菌门丛枝菌根真菌最新分类系统菌种名录》 做了系统性地校正和说明。 Rhizophagus irregularis  DAOM197198也就是 Rhizophagus irregularis  DAOM 181602，毫无疑问是国内外AMF研究中出镜率最高的菌种/株，因此该物种的基因组备受关注，而且也有比较成熟和完善的基因组网站。

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2.  明根孢囊霉（ Rhizophagus clarus  HR1 ）

Rhizophagus clarus  HR1分离于日本爱知县，是日本菌根界较为常用的一个模式菌种/株。目前， 该菌种/株已实现高效的非共生产孢 。

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3.  地表多样孢囊霉（ Diversispora epigaea  IT104 ）

Diversispora epigaea 以前被称为 Glomus versiforme 。但是根据 《球囊菌门丛枝菌根真菌最新分类系统菌种名录》 ， Diversispora epigaea 中文种名译为地表多样孢囊霉，而 Glomus versiforme 中文种名译为变形球囊霉，这里我们使用“地表多样孢囊霉”。

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4.  Rhizophagusdiaphanous MUCL43196

暂时未找到这个菌种的中文译名。

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5.  脑状球囊霉（ Rhizophagus cerebriforme  DAOM227022 ）

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6. 玫瑰红巨孢囊霉（ Gigaspora rosea  DAOM194757 ）

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7.  梨形地管囊霉（ Geosiphon pyriformis ）

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8. 球状巨孢 囊霉（ Gigaspora margarita  BEG34 ）

球状巨孢囊霉，也被称为珠状巨孢囊霉。 Gigaspora margarita BEG34这个菌种/株频繁出现在近20年的菌根研究中，也是一个较为知名的菌种/株。该基因组测序是由意大利都灵大学（University of Turin）的Paola Bonfante教授团队完成。

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网站链接：[Organism:noexp]

编辑 ∣ 冯曾威

审核 ∣ 姚青

广东省科学院微生物研究所菌种组 - 华南农业大学园艺学院土壤微生物组联合团队

中国批准的7种益生菌有哪些？

可用于保健食品的真菌菌种名单：

1、酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae。

2、产朊假丝酵母Cadida atilis。

3、乳酸克鲁维酵母Kluyveromyces lactis。

4、卡氏酵母Saccharomyces carlsbergensis。

5、蝙蝠蛾拟青Paecilomyces hepiali Chen et Dai, sp. nov。

6、蝙蝠蛾被毛孢Hirsutella hepiali Chen et Shen。

7、灵芝Ganoderma lucidum。

8、紫芝Ganoderma sinensis。

9、松杉灵芝Ganoderma tsugae。

10、红曲霉Monacus anka。

11、紫红曲霉Monacus purpureus。

第五条　申报真菌类保健食品，除按《卫生部保健食品申报与受理规定》的要求提交资料外，还应提供以下资料：

1、 产品配方及配方依据中应包括确定的菌种属名、种名及菌种号。菌种的属名、种名应有对应的拉丁文。

2、菌种的培养条件(培养基、培养温度等)。

3、菌种来源及国内外安全食用资料。

4、经卫生部认定的检定机构出具的菌种检定报告。

5、菌种的安全性评价资料(包括毒力试验)。菌种及其代谢产物必须无毒无害，不得在生产用培养基内加入有毒有害物质和致敏性物质。有可能产生抗菌素或真菌毒素的菌种还应包括有关抗菌素和真菌毒素的检测报告。

以上内容参考：中国政府网-卫生部关于印发真菌类和益生菌类保健食品评审规定

哪些菌种可以用于食品？

谣言：

益生菌有一定的生理功能，要多吃富含益生菌的加工食品有利身体健康。

辟谣：

哪些菌种可以用于食品？

我国在2001年发布了《可用于保健食品的益生菌菌种名单》以及《可用于保健食品的真菌菌种名单》，名单包括两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）、婴儿双歧杆菌（Bifidobacterium infantis）等10个菌种。

我国还先后于2010年和2011年发布《可用于食品的菌种名单》和《可用于婴幼儿食品的菌种名单》，并在随后几年以公告形式对名单进行了增补。

截止2019年，可用于食品的菌种名单中包括了35个种或亚种，可用于婴幼儿食品的菌种包含：

嗜酸乳杆菌

（Lactobacillus acidophilus）NCFM

动物双歧杆菌

（Bifidobacterium animalis）Bb-12

乳双歧杆菌

（Bifidobacterium lactis）HN019

等9个菌株。

不在名单中、且在我国没有传统安全食用历史的微生物菌种，应按照相应的管理规定，申报获得批准后才可用于食品。

目前，批准详单将尽快整理发布。

是否所有可食用的微生物都是益生菌？

当然，并非所有的可食用微生物都可称之为益生菌。我国益生菌常用于食品、膳食补充剂，和活菌药物及微生态活菌制剂。

近年来，随着“益生菌”这一概念的广泛应用，市面上存在将“益生菌”的概念作为广告噱头滥用的情况。

中国营养学会益生菌益生元与健康分会于2019年5月29日发布的《益生菌与健康专家共识》对益生菌的定义是：

益生菌是活的微生物，当摄入充足的数量时，对宿主产生健康益处。

发酵食品中的微生物不能直接称为益生菌，肠道中的有益菌、粪菌移植物及相关制品也不属于当前益生菌概念。

只有在进行分离鉴定、安全评价及功能试验后且符合益生菌概念的，才能称为益生菌。

益生菌有哪些特性？

1

益生菌必须是活的

2

益生菌必须是安全的

3

益生菌的作用与其剂量有关

4

必须有足够证据证明益生菌对人体是有益的

5

益生菌的作用具有菌株特异性

益生菌法规发展趋势

我国2001年发布的《益生菌类保健食品申报与审评规定（试行）》（国食药监注[2005]202号）规定：“益生菌类保健食品系指能够促进肠内菌群生态平衡，对人体起有益作用的微生态制剂”。

目前，现行的益生菌食品管理规定及相关技术规范已实施较长时间，部分规定和要求已无法适应益生菌研究的最新进展，也不能满足益生菌产业的发展要求。

如死菌及菌种代谢产物可以作为益生菌类保健食品的类别、标签标识未要求标示菌株号等。

因此，我国尚需结合国际上的经验，尽快完善相应的管理规定和技术规范，进一步细化菌种标准标识的相关规定，及时更新和完善益生菌类保健食品功效评价的相关技术规范，引导企业和科研机构合理开发和应用。

作为消费者，在选购宣称含有“益生菌”的食品时，应合理、理性购买和使用。

中国营养学会益生菌益生元与健康分会正着手制定详细的《益生菌与健康专家共识》，将会给出具体建议。

辟谣专家：

中国营养学会益生菌益生元与健康分会

向雪松 中国疾病预防控制中心营养与健康所

陈潇 国家食品安全风险评估中心

复核专家：

向雪松 中国疾病预防控制中心营养与健康所